等温扩增技术系列
近些年来，分子生物学技术的不断发展持续推动着分子诊断技术的升级迭代，伴随着新冠疫情的爆发，分子诊断技术在疾病诊断中发挥着重大作用，人们对分子诊断技术的重视程度达到了前所未有的高度。自沃森和克里克揭秘“生命之谜”-DNA双螺旋结构始，分子诊断经分子杂交技术、PCR技术、生物芯片技术和二代测序技术的不断发展后，已经在多个领域已得到广泛应用，如传染病的诊断、流行病学的调查、肿瘤和遗传病的早期诊断、食品卫生安全等。
其中，作为分子诊断经典技术之一的PCR，凭借其简便快速、高灵敏度、高特异性的优势，成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高、应用范围最广的技术。然而，PCR技术是在体外通过反复的温度变化来达到对目的片段在短时间内扩增数百万倍的效果，这也就意味着PCR技术无法摆脱仪器设备的局限，不仅如此，PCR技术操作起来比较复杂，对人员要求也比较高，这些问题进一步限制了其在临床现场检测中的应用。为了解决PCR这一局限性，自20世纪90年代以来，很多实验室开始自发的研究无需热变性的核酸等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology, IAT)。
等温扩增技术是核酸体外扩增技术，其反应过程始终在一个恒定的温度下进行，通过在反应体系中添加不同活性的酶和各种特异性的引物来达到快速扩增的目的。经过30多年的发展，主流的等温扩增技术包括环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物扩增(crossing priming amplification，CPA)、链替代扩增(strand displacement amplification，SDA)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)、依赖核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)和依赖解旋酶的扩增(helicase-dependent amplification，HDA)。
在这些恒温扩增技术中，以2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开的LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)，也就是环介导等温扩增反应最受关注，是目前最常见、应用最广泛的等温扩增技术，已占据超过60%的恒温检测市场。被广泛地运用在病原微生物检测和传染性疾病诊断等领域，如SARS、AIV、HIV、COVID-19等疾病的检测中，为已知基因的检测提供简便、快速、特异、经济的检测方法，显示出令人鼓舞的应用前景。
LAMP原理
最初的LAMP反应是针对目的DNA链上的6个区域（F3、F2、F1、B1、B2、B3）设计4条引物，包含一对外引物（F3&B3）和一对内引物（FIP&BIP）。其原理是利用双链DNA在65℃左右处于动态平衡状态，在此温度下，引物结合在双链DNA的互补部位，链置换DNA聚合酶将DNA双链解开并进行链置换，使DNA在15-60分钟内即可扩增109-1010倍。
LAMP扩增体系
基于LAMP扩增的原理，LAMP的扩增体系包括4条特异性引物、Bst DNA聚合酶缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、MgSO4。
4条特异性引物的组成：
· 正向外引物F3：由F3区域组成，该区域与F3c区域互补；
· 反向外引物B3：由B3区域组成，该区域与B3c区域互补。
· 正向内引物FIP：由与F2c区互补的F2区（3’端）和与5’端的F1c区相同序列组成。
· 反向内引物BIP：由与B2c区互补的B2区（3'端）和与5'端的B1c区域相同序列组成。
LAMP引物设计
正确的引物设计对于进行LAMP扩增至关重要，LAMP引物设计时，需注意以下几点：
· 引物间距：F2和B2的5'端之间的距离为120-180 bp，F2和F3以及B2和B3之间的距离为0-20 bp。茎环区域的距离（F2的5'到F1的3'，B2的5'到B1的3'）为40-60 bp。
· 引物的Tm值：高GC和正常情况下约60-65℃，高AT情况下约55-60℃。
· 引物末端的稳定性：从以下末端区域计算6bp的dG应小于-4 kcal/mol，分别是F1c/B1c 的5'末端和F2/B2以及F3/B3的3'末端。
· GC含量：高GC和正常的情况下约为50-60%，高AT的情况下约为40-50%。
· 二级结构：引物设计应避免形成二级结构，3'序列应避免高AT或与其他引物互补。
· 其他：如果目标序列上存在限制性内切酶位点，除了引物区域外，它们可以用来确认扩增产物。
LAMP反应核心的Bst DNA聚合酶，源于Geobacillus stearothermophilus（嗜热脂肪芽孢杆菌），原菌种生长于55-60℃的环境中。野生型Bst DNA Polymerase和其他DNA Polymerase I相似，包括三个活性区域: (I) 5’-3’外切酶活性结构域，(II) 5’-3’聚合酶活性结构域，(III) 3’-5’外切酶活性结构域，结构域II和III称为大片段(LF)（大片段的反应效率比全长Bst高），位于Bst DNA聚合酶的羧基末端，缺失5’-3’外切酶活性。
Bst DNA聚合酶的链置换原理
LAMP扩增步骤
当目的基因和试剂在65℃条件下孵育时，等温扩增反应分为2个阶段进行，分别是哑铃状模板结构的形成过程、循环扩增阶段以及延伸循环阶段。步骤如下：
1. 哑铃状模板结构的形成：内引物结合目的基因，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸为双链。外引物与双链DNA的5’结合，在一端形成环状结构。另一端经过同样过程，形成两端为环的哑铃状结构。
2. 循环扩增阶段以及延伸循环阶段：以哑铃结构DNA单链自身为模板不断形成一端开口的过渡性茎环结构DNA，由内外引物引导过渡性茎环结构DNA不断发生链置换延伸反应，最后形成具有多个茎环结构的长度不一的DNA混合物。
LAMP扩增步骤
LAMP扩增产物检测
LAMP扩增后可产生大量具有不同长度、不同数目茎环结构和反向重复序列的DNA混合物，此外，随着扩增反应的不断进行，副产物焦磷酸镁的含量也在不断增加。由于LAMP反应的特殊性，其扩增产物的检测也存在多种方式。
· 琼脂糖凝胶电泳法：通过琼脂糖凝胶电泳对LAMP扩增产物进行检测，检测结果呈现瀑布状梯形条带，针对扩增产物中所包含的特异性酶切位点进行酶切，还可以对扩增产物的特异性进行验证。但高浓度DNA产物容易产生气溶胶造成实验室环境污染。
· 浊度分析鉴定法：LAMP反应的效率极高，核酸在大量合成的同时，由dNTP析出的焦磷酸根离子与体系中的镁离子结合，产生副产物焦磷酸镁，形成乳白色沉淀，焦磷酸镁的产量与扩增产物浓度存在一定相关性。可用肉眼观察扩增终末阶段的乳白色沉淀判断扩增有效性，也可利用浊度仪对浊度变化进行实时监测。但浊度信号是来源于LAMP反应的副产物，而不是由引物特异性扩增的直接产物，因此无法完全排除检测到非特异性扩增（如，由宿主来源的近源DNA片段或引物二聚体）的可能。
· 染色检测法：根据染料对反应是否产生抑制，染料可在反应后或反应前添加。在反应后开盖添加，易在空气中产生气溶胶，并在之后的检测中造成假阳性。染料和辅助剂的种类也会对反应效率及结果判断造成影响。因此，根据染料、辅助剂的作用特点进行合理的选择及应用，对LAMP结果的正确性和可靠性有重要意义。染料的种类有很多，应用较多的有3种：钙黄绿素、SYBR Green 和羟基萘酚蓝。
· 免疫试纸条法：特异性扩增产物能够同时被质控线（C）和检测线（T）上的抗体捕获并显现为两条红色条带，而非特异性扩增的样品则仅仅显示为质控线（C）红色，但该方法需要借助其他的装置来防止核酸扩增结束后开盖可能造成的交叉污染。
· 实时荧光法：利用SYBR Green I等荧光染料能够与双链DNA特异性结合的特性，通过核酸扩增过程中的荧光强度变化来实时、定量地检测双链DNA的产量。该方法具有重复性高、能够定量、实时分析的特点，但需要复杂的仪器，成本高。
· 荧光探针法：向LAMP反应体系中加入标记不同荧光素的特异性探针，可用于多重基因的检测，具有灵敏度高、特异性强等优势。但需要复杂的仪器，成本高。
· 微流控芯片法：该方法具有特异性强、敏感度高、耗样量少、耗时短、检测效率高、操作简便等诸多优点。将环介导等温核酸扩增和微流控芯片技术相结合，建立单重/多重、定性/定量的LAMP微流控芯片模块，有利于发展快速、灵敏、特异和适合床边检测的生物分子分析技术。但需要复杂的仪器，成本高。
LAMP的优势与限制
LAMP的优势：
· 不需额外的步骤将双链DNA变成单链DNA；
· 扩增反应在等温条件下连续进行；
· 扩增效率极高，在15-60分钟内使DNA的量放大109-1010倍；
· 通过4个引物来识别6个区域，扩增的特异性强；
· 不需要特殊的试剂或复杂的设备，成本低；
· RNA模板的扩增过程与DNA模板相同，只需添加逆转录酶。
LAMP的限制：
· 引物设计要求高；
· 产物不能用于克隆或测序；
· 容易形成气溶胶污染，造成假阳性。
产品推荐
亚洲必赢国际437app作为国产生物试剂优质供应商，为满足广大客户对LAMP技术在病原微生物检测、传染性疾病诊断和食品卫生安全等领域的应用需求，推出Bst II DNA Polymerase和Bst III DNA Polymerase，助力诊断试剂开发。
适用于以DNA为模板的LAMP反应，扩增能力强、特异性高，在荧光定量法（染料法、探针法）LAMP反应中具有极佳的反应性能。
产品特点：
· 操作简单：包含反应所需组分，只需自备模板及引物探针即可；
· 高效率：强链置换及聚合酶活性，实现恒温条件下快速、高效、特异性的LAMP扩增；
· 兼容dUTP/UDG：对dUTP耐受性好，添加dUTP/UDG有效防止LAMP产物的交叉污染，数据准确。
实验数据：
兼容dUTP/UDG防污染系统
以ASFV-p72质粒和Pre-LAMP Product为模板，使用TransGen产品进行LAMP扩增。结果表明，TransGen产品对dUTP耐受性好，高度兼容dUTP/UDG系统，有效避免交叉污染。
扩增灵敏度高
以不同浓度的番鸭细小病毒（MDPV）质粒为模板，使用TransGen产品进行LAMP扩增。结果表明，TransGen产品扩增灵敏性高，特异性好，检出限可到fg级别。
注：1*102 copies浓度为fg级别
扩增速率快
在同等模板浓度条件下，分别使用TransGen产品和Company N产品进行LAMP扩增。结果表明，TransGen产品扩增速率更快。
反应可视化
以ASFV-p72基因质粒为模板，使用TransGen产品进行浊度法、HNB和中性红显色法LAMP扩增，63℃反应30 min。结果表明TransGen产品可进行可视化操作，扩增结果均可通过颜色变化进行判读。
1-4：ASFV-p72基因质粒；5-8：NTC
Bst III DNA Polymerase (LP311)
适用于以RNA为模板的RT-LAMP反应，具有极强的反转录活性和扩增能力，可在30分钟内检测低至1拷贝的RNA分子，适用于荧光染料法、荧光探针法。
产品特点：
· 操作简单：包含反应所需组分，只需自备模板及引物探针即可；
· 高效率：一步法进行反转录（RT）及LAMP扩增，恒温条件下快速、高效、特异性的扩增模板；
· 兼容dUTP/UDG：对dUTP 耐受性好，添加dUTP/UDG有效防止LAMP产物的交叉污染，数据准确；
· 提供可冻干反应体系：高浓度Bst III酶活稳定，可用于冻干反应体系的建立。
实验数据：
扩增效率高
以鸭、鹅呼肠孤病毒（DuRV）体外转录RNA为模板，分别使用TransGen产品和Company N产品进行LAMP扩增。结果表明，TransGen产品扩增效率更高。
扩增灵敏度高
以不同浓度的鸭、鹅呼肠孤病毒（DuRV）体外转录RNA为模板，使用TransGen产品进行RT-LAMP扩增。结果表明，TransGen产品扩增灵敏性高，特异性好，检出限可到fg级别。
注：1 copy浓度为fg级别
可进行冻干
以鸭、鹅呼肠孤病毒（DuRV）体外转录RNA为模板，使用常规和冻干体系 TransGen产品进行RT-LAMP扩增。结果表明，TransGen产品扩增效果稳定，可用于冻干体系研究。
参考文献：
【1】 Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): The Better Sibling of PCR?. Cells. 2021;10(8):1931. Published 2021 Jul 29.
【2】 Li JJ, Xiong C, Liu Y, Liang JS, Zhou XW. Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): Emergence As an Alternative Technology for Herbal Medicine Identification. Front Plant Sci. 2016;7:1956. Published 2016 Dec 26.
【3】 姜苏,李一荣.等温扩增技术的原理及应用[J].中华检验医学杂志,2020,43(05):591-596.
